本发明公开了一种检测抗生素残留的适配体传感器的制备方法，属于农产品安全检测技术领域。本发明通过将金电极与硫堇进行电聚合，获得电聚合硫堇电极，再将预配好的碳纳米管-石墨烯纳米复合物均匀滴涂到电聚合硫堇电极表面，晾干后，再将电极浸入到抗生素适配体溶液中，冲洗晾干后，再用BSA溶液封闭，获得抗生素适配体传感器。本发明所制备的适配体传感器具有不用经过预处理、分析速度快、操作系统简单、准确度高、专一性强、成本低、响应快等优点，检测限达到0.8nM，适用于抗生素残留的快速检测。
1.一种检测抗生素残留的适配体传感器的制备方法，其特征在于，将金电极与硫堇进行电聚合，获得电聚合硫堇电极，再将预配好的碳纳米管-xa0石墨烯纳米复合物滴涂到电聚合硫堇电极表面，晾干后将电极浸入到抗生素适配体溶液中，冲洗晾干后用BSAxa0溶液封闭，获得抗生素适配体传感器。
2.根据权利要求1xa0所述方法，其特征在于，所述抗生素为卡那霉素。
3.根据权利要求1xa0所述方法，其特征在于，步骤如下：1）制备碳纳米管-xa0石墨烯纳米溶液；2）清洗、活化并测试金电极；3）将步骤2）所得金电极进行电聚合硫堇，获得电聚合硫堇电极；4）在步骤3）所得电聚合硫堇电极上均匀滴涂步骤1）制备的碳纳米管-xa0石墨烯纳米溶液，获得纳米涂膜电极；5）将步骤4）所得纳米涂膜电极浸入到抗生素适配体溶液中，冲洗晾干后获得适配体电极；6）利用BSAxa0溶液封闭步骤5）所得适配体电极，晾干后获得适配体传感器。
4.根据权利要求3xa0所述方法，其特征在于，步骤1）所述制备碳纳米管-xa0石墨烯纳米溶液，是取100mgxa0碳纳米管加入到2.6mol/Lxa0的HNO3xa0中，在140℃下回流6h,xa0抽滤，用超纯水洗涤至中性，加入石墨烯后将溶液分散在N,N-xa0二甲基甲酰胺中，再用超声波分散，直到得到黑色悬浊液。
5.根据权利要求3xa0所述方法，其特征在于，步骤2）所述清洗、活化并测试金电极，是利用热piranhaxa0溶液浸泡金电极后，再用Al2O3xa0浆抛光，xa0再依次用去离子水、HNO3、无水乙醇和去离子水超声清洗，干燥后用循环伏安法活化，并通过检测金电极循环伏安曲线峰电位差测试金电极。
6.根据权利要求3xa0所述方法，其特征在于，步骤3）所述电聚合硫堇，是将预处理好的金电极放入含0.10mol/Lxa0的HNO3xa0和4mmol/Lxa0硫堇的磷酸盐缓冲液中，在-0.1~1.4Vxa0范围内，以50mV/sxa0的速度循环扫描30xa0圈，取出清洗。
7.根据权利要求3xa0所述方法，其特征在于，步骤4）所述滴涂碳纳米管-xa0石墨烯纳米溶液，是取5μLxa0碳纳米管-xa0石墨烯纳米复合液滴涂在电聚合硫堇电极表面，20℃下静置2h，然后用pH7.5xa0的磷酸盐缓冲液冲洗，氮气吹干。
8.根据权利要求3xa0所述方法，其特征在于，步骤5）所述浸入到抗生素适配体溶液中，浸泡时间为0.5h，浸泡温度为4℃。
9.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤6）所述用BSAxa0溶液封闭电极，BSAxa0溶液浓度为0.5%，封闭温度为20℃，封闭时间为2h。
10.根据权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下：1）取100mgxa0碳纳米管加入到2.6mol/Lxa0的HNO3xa0中，在140℃下回流6h,xa0抽滤，用超纯水洗涤至中性，加入石墨烯后将溶液分散在N,N-xa0二甲基甲酰胺中，再用超声波分散，直到得到黑色悬浊液，获得碳纳米管-xa0石墨烯纳米复合溶液；2）利用热piranhaxa0溶液浸泡金电极后，用Al2O3xa0浆抛光，再依次用去离子水、HNO3、无水乙醇和去离子水超声清洗，干燥后用循环伏安法活化，并通过检测金电极循环伏安曲线峰电位差测试金电极，获得预处理金电极；3）将步骤2）所得的预处理金电极放入含0.10mol/Lxa0的HNO3xa0和4mmol/Lxa0硫堇的磷酸盐缓冲液中，在-0.1~1.4Vxa0范围内，以50mV/sxa0的速度循环扫描30xa0圈，取出清洗干燥后获得电聚合硫堇电极；4）取5μLxa0步骤3）制备的碳纳米管-xa0石墨烯纳米复合溶液滴涂在步骤3）所得电聚合硫堇电极表面，20℃下静置2h，然后用pH7.5xa0的磷酸盐缓冲液冲洗，氮气吹干后获得纳米涂膜电极；5）将步骤4）所得纳米涂膜电极浸入到抗生素适配体溶液中浸泡时间为0.5h，浸泡温度为4℃，冲洗晾干后获得适配体电极；6）将步骤5）所得适配体电极浸入0.5%xa0的BSAxa0溶液中，室温封闭0.5hxa0后晾干得到适配体传感器。技术领域
本发明涉及一种检测抗生素残留的适配体传感器的制备方法，属于农产品安全检测技术领域。技术背景抗生素作为一种治疗疾病的药物，目前已经被广泛应用在乳牛的疾病治疗。无论是通过肌肉注射还是口服，进入奶牛体内的抗生素都是可以通过乳牛的新陈代谢排出体外，并且牛乳就是乳牛把抗生素类物质排泄出体外的一种重要途径。因此牛奶中的抗生素残留的问题，一般专家调查认为，泌乳期乳牛的用药不当和安全时间不注意是牛奶中的抗生素残留的重要的两个来源，特别是使用乳房灌注法治疗乳腺炎时，易造成牛乳中抗生素残留。牛奶是老少皆宜的营养品，牛奶中若含有抗生素，对长期饮用者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，对抗生素过敏的人服用残留抗生素的乳后会发生过敏反应。即使是正常饮用者，体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。为了预防和解决抗生素残留造成的食品污染和人体安全等问题,现在最有效的策略就是尽早尽快地找到高效、灵敏、准确的检测残留卡那霉素方法。目前我国已经加入WTO，这就使得我们与世界各国的贸易往来变得现实并且严肃，这就要求我们更加注重卡那霉素残留的检测以及预防。抗生素残留的检测方法多种多样，每种方法都有各自特点，适应在不同条件下检测。在选用各种方法时我们应当根据简便易用、精确可靠的原则。常用的抗生素残留检测方法有气相色谱法（GC）、光谱法、高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）、适配体分析法等。这些分析方法虽然具有高选择性，但是由于操作繁琐、耗时长、成本高，并且需对样品进行预浓缩和衍生处理，所以很难得到广泛应用。因此，人们会更加急切的需要快速、可靠、经济和适合于现场应用的快速检测方法。于是,快速、可信、廉价、敏感的适配体生物传感器应运而生。与传统的分析方法相比,适配体生物传感器具有待测的样品不用经过预先处理、分析速度快、操作系统简单、准确度高、专一性强、成本低、响应快等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、灵敏度高、选择性好的检测抗生素残留的电流型适配体传感器的制备方法。采用的技术方案为：一种检测抗生素残留的适配体传感器的制备方法，是将金电极(d=2mm)与硫堇进行电聚合，获得电聚合硫堇电极，再将预配好的碳纳米管-石墨烯纳米复合物均匀滴涂到电聚合硫堇电极表面，晾干后，再将电极浸入到抗生素适配体溶液中，冲洗晾干后，再用BSA溶液封闭，获得抗生素适配体传感器。所述方法的步骤如下：1）xa0xa0制备碳纳米管-石墨烯纳米溶液；2）xa0xa0清洗，活化并测试金电极；3）xa0xa0将步骤2）所得金电极进行电聚合硫堇，获得电聚合硫堇电极；4）xa0xa0在步骤3）所得电聚合硫堇电极上均匀滴涂步骤1）制备的碳纳米管-石墨烯纳米溶液，获得纳米涂膜电极；5）xa0xa0将步骤4）所得纳米涂膜电极浸入到抗生素适配体溶液中，冲洗晾干后获得适配体电极；6）xa0xa0利用BSA溶液封闭步骤5）所得适配体电极，晾干后获得适配体传感器。所述方法的步骤1）所述制备碳纳米管-石墨烯纳米溶液，是取100mg碳纳米管加入到2.6mol/L的HNO₃中，在140℃下回流6h,xa0抽滤，用超纯水洗涤至中性，加入石墨烯后将溶液分散在N,N-二甲基甲酰胺中，再用超声波分散，直到得到黑色悬浊液。所述方法的步骤2）所述清洗，活化并测试金电极，是利用热piranha溶液浸泡金电极后，再用Al₂O₃浆抛光，在依次用去离子水、HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，干燥后用循环伏安法活化，并通过检测金电极循环伏安曲线峰电位差测试金电极。所述方法的步骤3）所述电聚合硫堇，是将预处理好的金电极放入含0.10mol/L的HNO₃和4mmol/L硫堇的磷酸盐缓冲液中，在-0.1~1.4V范围内，以50mV/s的速度循环扫描30圈，取出清洗。所述方法的步骤4）所述滴涂碳纳米管-石墨烯纳米溶液，是取5μL碳纳米管-石墨烯纳米复合液滴涂在电聚合硫堇电极表面，20℃下静置2h，然后用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗，氮气吹干。所述方法的步骤5）所述浸入到抗生素适配体溶液中，浸泡时间为0.5h，浸泡温度为4℃。所述方法的步骤6）所述用BSA溶液封闭电极，BSA溶液浓度为0.5%，封闭温度为20℃，封闭时间为2h。所述方法的具体步骤如下：1）xa0取100mg碳纳米管加入到2.6mol/L的HNO₃中，在140℃下回流6h,xa0抽滤，用超纯水洗涤至中性，加入石墨烯后将溶液分散在N,N-二甲基甲酰胺中，再用超声波分散，直到得到黑色悬浊液，获得碳纳米管-石墨烯纳米复合溶液；2）xa0利用热piranha溶液浸泡金电极后，用Al₂O₃浆抛光，再依次用去离子水、HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，干燥后用循环伏安法活化，并通过检测金电极循环伏安曲线峰电位差测试金电极，获得预处理金电极；3）xa0将步骤2）所得的预处理金电极放入含0.10mol/L的HNO₃和4mmol/L硫堇的磷酸盐缓冲液中，在-0.1~1.4V范围内，以50mV/s的速度循环扫描30圈，取出清洗干燥后获得电聚合硫堇电极；4）xa0取5μL步骤1）制备的碳纳米管-石墨烯纳米复合溶液滴涂在步骤3）所得电聚合硫堇电极表面，20℃下静置2h，然后用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗，氮气吹干后获得纳米涂膜电极；5）xa0将步骤4）所得纳米涂膜电极浸入到抗生素适配体溶液中浸泡时间为0.5h，浸泡温度为4℃，冲洗晾干后获得适配体电极；6）xa0将步骤5）所得适配体电极浸入0.5%的BSA溶液中，室温封闭0.5h后晾干得到适配体传感器。本方法的有益效果：本发明采用电聚合硫堇、滴涂碳纳米管-石墨烯纳米复合物对金电极进行修饰。电聚合硫堇具有较高的比表面积、良好的稳定性和导电性，可以增大电极表面电子的转移和生物相容性，进而增大适配体传感器的响应电流，并且沉积过程简单、省时、可控；本发明先在组装好的电极表面修饰上生物素化的适配体，再吸附亲和素，最后再将生物素修饰DNA固定到修饰电极上来对卡那霉素实时检测。卡那霉素和用不同基团修饰的卡那霉素适体形成夹层结构-“三明治结构”，使得检测度更高；采用本发明制成的电流型适配体传感器可以在牛奶集收、上市前，进行卡那霉素残留的快速测定，直接对抗生素残留量是否超标进行检测，检测限为8.6xa0nM。避免因饮用含有残留抗生素的牛奶而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
附图说明
图1.工作电极表面修饰不同纳米材料后的循环伏安曲线；（a.裸金电极；b.硫堇/金电极；c.石墨烯-聚苯胺/硫堇/金电极；d纳米金/石墨烯-聚苯胺/硫堇/金电极；e.适配体1/纳米金/石墨烯-聚苯胺/硫堇/金电极f.xa0BSA/适配体1/纳米金/石墨烯-聚苯胺/硫堇/金电极；g.适配体2-卡那霉素/BSA/适配体1/纳米金/石墨烯-聚苯胺/硫堇/金电极）；图2适配体传感器的标准曲线；（A．适配体传感器检测不同浓度的卡那霉素差分脉冲伏安曲线；B卡那霉素浓度与适配体传感器检测的电流变化线性关系曲线）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。实施例1xa0适配体传感器的制备一种检测卡那霉素的适配体传感器的制备步骤如下：(1)xa0碳纳米管-石墨烯纳米复合膜的制备：取100mg碳纳米管加入浓度为2.6mol/L的HNO₃在140℃的条件下回流6h，抽滤，用超纯水洗涤至pH为中性。将石墨烯加入到上述溶液中，并将其上述溶液分散在N，N-二甲基甲酰胺中，然后将分散液用超声波分散，直到得到黑色的悬浮液；(2)xa0金电极的清洗：金电极修饰前，首先浸入热的“piranha”溶液(H₂SO₄:30%H₂O₂=3:1)中浸泡15min，用水清洗干净，接下来用0.3μm、30nm的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去除表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5min，重复二次，然后依次用6mol/L的HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥；(3)金电极的活化：彻底清洗后，电极在0.5mol/Lxa0H₂SO₄溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0V～-1.0V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止； xa0(4)预处理好的金电极的测试：在含有1×10^-3mol/LK₃Fe(CN)₆的0.20mol/LKNO₃溶液中跑循环伏安曲线，以测试所述金电极的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0.1V～0.6V；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在80mV-120mV以下，并尽可能接近64mV，所述金电极可使用，否则要重新返回步骤(2)中，处理所述金电极，直到符合要求，图1为修饰不同试剂后电极循环伏安曲线；(5)xa0将预处理好的金电极放入含电解液由在含0.10mol/L的硝酸和4mmol/L硫堇的磷酸盐缓冲液中，在-0.1~1.4V的电位范围内，以50mV/s的速度循环扫描30圈，取出清洗；(6)电极表面晾干后，取5μL碳纳米管-石墨烯纳米复合液滴涂在电极表面，常温下静置2h，然后用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗，氮气吹干；(7)将电极沉浸在卡那霉素的适配体溶液中，4°C条件下浸泡0.5h，取出后用磷酸盐缓冲液冲洗表面，晾干待用；(8)最后将上述制备好的电极浸于0.5%的BSA溶液中，室温下静置2h，以封闭非特异性结合位点，取出置于室温下晾干，适配体传感器制作完成，保存在4°C条件下备用。实施例2xa0适配体使用条件优化及检测限测定1.xa0xa0xa0适配体使用条件优化适配体浓度、测试底液pH、测试温度和适配体和抗生素特异性结合时间四方面对所制备的适配体传感器的实验条件进行优化。测得的最佳测试底液的pH为7.5，最佳适配体的浓度为5μg/mL，适配体和卡那霉素特异性结合的最优时间与温度分别为60xa0min和35℃；2.xa0xa0xa0适配体检测限测定配置0.01ng/mL到200.0ng/mL的卡那霉素标准溶液，将上述制备好的适配体传感器分别浸入不同浓度的卡那霉素标准溶液，在常温下特异性反应60min，检测适配体与相应卡那霉素特异性反应前后电流变化得到其工作曲线（图2），测得检测限为8.6xa0nM。本发明的一种抗生素残留检测的适配体传感器制备方法用于抗生素残留的检测，方法操作工艺简单，检测时间较短，检测卡那霉素浓度范围广，灵敏度高。为了考察该传感器的稳定性，将电极放在冰箱4℃下15天，测得该传感器响应电流下降约9.4％，表示该传感器的稳定性良好。将电极修饰后重复使用6次，测得相对标准偏差（RSD）为5.6％，表示该传感器的再生能力高。用相同的修饰方法组装完五个传感器，连续测3次，测得RSD为5.3％，表示该传感器重现性表较好。为了进一步的研究该适配体传感器的实用价值，在超市购买普通牛奶，将其用0.1Mxa0pH7.5的磷酸盐缓冲液稀释5倍，加入不同浓度的卡那霉素后测试。对添加卡那霉素后的牛奶进行检测，回收率率在97.2–104.9%之间，由此证明，该适配体传感器可用于实际样品的初步检测，符合我国抗生素残留快速检测技术发展和国际化要求。